Corpo Discente - Egressos
Mellanie Karoline do Carmo Félix
| Título | DESENVOLVIMENTO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES BASEADAS NO GENE DE ALFA TOXINA DE Clostridium novyi TIPO B E AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE PROTETORA CONTRA CLOSTRIDIOSES | ||||||||||||||||||||||||
| Data da Defesa | 11/08/2023 | ||||||||||||||||||||||||
| Download | Em sigilo | ||||||||||||||||||||||||
Banca
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| Palavras-Chaves | Alfa toxina; Epítopos vacinais; Clostridium novyi; bioprocessos. | ||||||||||||||||||||||||
| Resumo | Clostridium novyi (C. novyi) é um agente comum em animais domésticos e humanos, classificado de acordo com a produção de toxinas. A toxina alfa é a causa primária da patogênese, altera a permeabilidade vascular levando à necrose e morte. Como C. novyi é um microrganismo exigente, a obtenção de alfa-toxina tem sido cara, levando a falhas durante várias etapas do bioprocessamento. A alfa toxina é um imunógeno composto por 2178 aminoácidos integrados em várias vacinas antigênicas usadas para imunizar ruminantes. Dada a relevância desses imunógenos em vacinas anti-Clostridium, propusemos um estudo in sílico para selecionar epítopos em culturas de Escherichia coli BL21 pLysS (DE3) com aumento de escala em um reator biológico tanque não agitado. Primeiramente, usamos um reator biológico de tanque agitado (escala laboratorial) usando cultura DE3 com o objetivo de entender a produção de epítopos vacinais a partir da alfa toxina de C. novyi. Nosso objetivo final foi propor uma produção utilizando um reator biológico tanque não agitado para promover melhores condições para bioprocessos e alternativas para a produção de imunógenos de baixo custo operacional. Nossos resultados revelaram que DE3 no sistema agitado revelou rendimentos de massa seca (RMS) de 0,77 g/L em um lote e 1,03 g/L em um lote alimentado com síntese de epítopos, sem produção de ácido acético. Com o aumento de escala usando um sistema sem agitação mecânica, houve maior DMY (1,20 g/L) com 0,56 mmol/mL de DE3/Ep1 e 0,61 mmol/mL de DE3/Ep2, com perfil semelhante para O2 consumo e glicose, sem produção de ácido acético. Os parâmetros µ(h-1 ), YX/S, YP/S, QP e QX não diferiram significativamente quanto à síntese de epítopos; entretanto, os dados cinéticos foram superiores aos dados em escala laboratorial. Após, propusemos uma nova formulação vacinal, em emulsificação água-óleo (W/O), na proporção 40% de antígeno (DE3/Ep1 e DE3/Ep2) e 60% óleo mineral adjuvante Montanide ISA 61VG. Os resultados indicaram eficácia de 25%, 37.5% e 75% na imunização dos grupos G2, G3 e G4, respectivamente. Nossos achados sugerem que ferramentas in sílico permitem seleção e síntese eficientes de epítopos usando DE3, permitindo a padronização de bioprocessos para obter imunógenos economicamente relevantes em um sistema sem agitação mecânica. Este sistema reduz custos e proporciona avanços tecnológicos para a indústria de produção de vacinas veterinárias | ||||||||||||||||||||||||
| Abstract | Clostridium novyi (C. novyi) is a common agent in domestic animals and humans, classified according to toxins production. Alpha toxin is the primary cause of pathogenesis; it alters vascular permeability leading to necrosis and death. Because C. novyi is a fastidious microorganism, obtaining alphatoxin has been expensive, leading to failure during various bioprocessing stages. Alpha toxin is an immunogen consisting of 2178 amino acids integrated into several antigen vaccines used to immunize ruminants. Given the relevance of these immunogens in anti-Clostridium vaccines, we proposed an in silico study to select epitopes in Escherichia coli BL21 pLysS (DE3) cultures with scale-up in an non-agitated tank biological reactor. Firstly, we used a stirred tank biological reactor (lab-scale) using DE3 culture aiming to understand the production of vaccine epitopes from C. novyi alpha-toxin. Our ultimate objective was to propose a production using a non-agitated tank biological reactor to promote improved conditions for bioprocesses and alternatives for the production of immunogens of low operating cost. Our results revealed that DE3 in the agitated system revealed dry mass yields (DMY) of 0.77 g/L in a batch and 1.03 g/L in a fed-batch with epitope synthesis, without acetic acid production. With scale-up using a system without mechanical agitation, there was higher DMY (1.20 g/L) with 0.56 mmol/mL of DE3/Ep1 and 0.61 mmol/mL of DE3/Ep2, with a similar profile for O2 consumption and glucose, without acetic acid production. The parameters µ(h-1 ), YX/S, YP/S, QP, and QX did not differ significantly regarding epitope synthesis; however, kinetic data were superior to laboratory-scale data. Afterwards, we proposed a new vaccine formulation, in water-oil emulsification (W/O), in the proportion of 40% antigen (DE3/Ep1 and DE3/Ep2) and 60% Montanide ISA 61VG adjuvant mineral oil. The results indicated efficacy of 25%, 37.5% and 75% in immunization of the G2, G3 and G4 groups, respectively. Our findings suggest that in silico tools allow efficient selection and synthesis of epitopes using DE3, enabling standardization of bioprocesses to obtain economically relevant immunogens in a system without mechanical agitation. This system reduces costs and provides technological advances for the veterinary vaccine production industry. | ||||||||||||||||||||||||
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