Corpo Discente - Egressos
Saara Neri Fialho
| Título | DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO PRÉ-CLÍNICA DE UMA FORMULAÇÃO PARA ENTREGA TRANSDÉRMICA DA HEXAMETOXILOBELANINA E DA PELITORINA APLICADOS AO TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA | ||||||||||||||||||||||||
| Data da Defesa | 29/09/2023 | ||||||||||||||||||||||||
| Download | Visualizar a Tese(3.24MB) | ||||||||||||||||||||||||
Banca
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| Palavras-Chaves | Leishmania spp.; Hexametoxilobelanina; Pelitorina; Sistema de entrega transdérmica. | ||||||||||||||||||||||||
| Resumo | As leishmanioses pertencem a um complexo de doenças infecto-parasitárias causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania, considerada uma doença negligenciada e endêmica em 97 países. Esse cenário aponta para a urgência de descoberta de novos fármacos, assim como para o desenvolvimento de novos sistemas terapêuticos. Nesse contexto, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a atividade leishmanicida da substância hexametoxilobelanina (S4) e da amida pelitorina in vitro e investigar a potencial aplicação tópica in vivo. Para tanto, utilizou - se cepas de Leishmania spp. obtidas do banco de Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz. As formas promastigotas foram cultivadas em meio RPMI-1640 e avaliadas através da curva de crescimento por 12 dias. A citotoxicidade foi testada em células de linhagem fibroblásticas – L929 e monocítica humanas – THP-1 usando as substâncias S4 e pelitorina. A linhagem THP-1 foi usada como modelo de infecção de Leishmania spp. As células infectadas foram tratadas com pelitorina ou S4 em concentrações variadas para determinação do IC50 e índice fagocítico. Para avaliação in silico das propriedades físico-químicas das substâncias relacionadas a permeação cutânea, foi usado o software SwissAdme. O índice de seletividade foi calculado como a razão entre CC50 e IC50. Foram determinados os comprimentos de onda de máxima absorção para S4 e pelitorina. Curvas analíticas (absorbância x concentração) foram construídas para ambas as substâncias utilizando espectrofotometria UV-Vis. As concentrações desconhecidas foram calculadas usando as equações das curvas analíticas. Filmes poliméricos de liberação prolongada foram produzidos utilizando Eudragit RS 100, propilenoglicol e acetona como solvente. Os componentes foram dissolvidos, aquecidos, adicionada a substância ativa (S4 ou pelitorina) e a solução foi evaporada para formar os filmes. Peles suínas de orelhas foram preparadas para estudos de permeação e retenção cutânea, sendo uma alternativa válida para avaliação in vitro de formulações tópicas. Os ensaios foram realizados em células de Franz, coletando amostras ao longo de 12 horas para análise da permeação e, posteriormente, a retenção cutânea foi avaliada com métodos de espectrofotometria UV-vis. Posteriormente, foi conduzido um estudo aprovado pela CEUA da FIOCRUZ RONDÔNIA, utilizando camundongos BALB/c fêmeas infectados com L. (L.) amazonensis. Os animais foram tratados com filmes poliméricos contendo pelitorina ou S4, sendo comparados com grupos controle. A xiii carga parasitária, fatores bioquímicos e evolução das lesões foram avaliados. Por fim, análises estatísticas foram realizadas para interpretar os resultados, através de regressões não lineares para calcular CC50 e IC50, usando GraphPad Prism 8 e Origin 9. O inchaço das lesões foi avaliado com Teste Two-way repeated measure ANOVA e teste de Tukey para múltiplas comparações. As diferenças foram consideradas significativas se p < 0,05. Ao analisar os resultados foi observado que a amida pelitorina demonstrou CC50 de 476,8 ± 7,28 µM para THP-1 e 363,7 ± 6,36 µM para L929, enquanto a substância S4 apresentou CC50 superior a 500 µM para ambas as linhagens. Todas as cepas tiveram fase log entre 1º e 3º dia. L. (V.) braziliensis teve fase log até o 7º dia. Fase estacionária variou entre 5º e 9º dia. A substância S4 inibiu 50% das amastigotas de L. (L.) infantum/chagasi a 145,7 ± 2,8 µM. Mas não demonstrou atividade frente L. (V.) braziliensis na maior concentração testada (200 µM), fato que impossibilitou o cálculo do IS para essa espécie. No entanto, o IS da S4 para L. (L.) infantum/chagasi foi calculado em 3,43. A pelitorina inibiu 50% dos amastigotas em L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum e L. (V.) braziliensis a 27,31 ± 3,68, 55,12 ± 3,97 e 128 ± 8,48 μM, respectivamente. A pelitorina demonstrou seletividade destacada para as amastigotas da L. (L.) amazonensis, com um índice de seletividade (IS) de cerca de 17,45 em relação às células THP-1 e 13,29 em relação às células L929. Para L. (V.) braziliensis, embora menor, ainda exibe uma seletividade moderada, com IS de aproximadamente 3,72 para THP-1 e 2,83 para L929. Já para L. (L.) infantum/chagasi, a pelitorina demonstra uma seletividade entre moderada e alta, com IS de cerca de 8,65 para THP-1 e 6,5 para L929. Os dados oriundos da curva analítica demonstraram uma relação linear entre a absorbância e a concentração, com coeficientes de correlação altos (0,995 para S4 e 0,999 para pelitorina), atendendo aos requisitos da ANVISA. Na análise de permeação cutânea, o filme foi aplicado na pele suína e continha uma quantidade total estimada de 0,111 mg de S4 ou pelitorina. Após 12 horas, cerca de 76,6% da S4 e 6,56% da pelitorina permearam através da pele. Quanto à retenção cutânea, após o mesmo período, aproximadamente 0,01757 mg de S4 e 0,026 mg de pelitorina foram retidos na pele. Os parâmetros de permeabilidade das substâncias S4 e pelitorina foram determinados através do teste de permeação cutânea. O fluxo constante (J) para a S4 foi de 2,69 µg/cm² × h, semelhante ao da pelitorina, que foi de 2,43 µg/cm² × h. O tempo necessário para atingir o equilíbrio de permeação foi de aproximadamente 0,95 horas para S4 e 1,1 horas para pelitorina. O coeficiente de permeabilidade da S4 foi 0,8 vezes maior em comparação com o da pelitorina. Em relação aos ensaios in vivo não foram observadas diferenças significativas no tamanho das lesões e peso dos animais entre os grupos tratados. No entanto, a análise da carga parasitária revelou uma redução na parasitemia dos camundongos tratados com a formulação de filme contendo pellitorina (inibição de 60,71%) ou S4 (inibição de 59,52%), sem diferença estatística xiv significativa entre eles. A formulação do filme por si só também mostrou redução da parasitemia (inibição de 71,54%). Todos os tratamentos foram eficazes comparados ao grupo controle não tratado. Os ensaios bioquímicos sorológicos não indicaram diferenças significativas nos níveis de ureia, creatinina, TGO e TGP em relação ao grupo controle não tratado. Isso sugere que os parâmetros analisados permaneceram dentro dos limites normais, indicando que os tratamentos não afetaram negativamente esses parâmetros bioquímicos. Diante dos resultados obtidos foi observado que a substância S4 é promissora, com baixa toxicidade in vitro (CC50 > 500 µM), assim como foi capaz de inibir amastigotas de L. (L.) infantum/chagasi in vitro. A amida pelitorina mostrou seletividade notável para L. (L.) amazonensis (IS ~17,45). Os testes de permeação cutânea demonstraram que o filme desenvolvido foi capaz de liberar ambas as substâncias (S4 e pellitorina) e essas apresentaram altos percentuais de permeação cutânea. Os tratamentos in vivo reduziram significativamente a parasitemia, sem afetar os parâmetros bioquímicos, destacando sua eficácia e segurança. | ||||||||||||||||||||||||
| Abstract | Leishmaniases belong to a complex of infectious parasitic diseases caused by various species of protozoa from the genus Leishmania, considered a neglected disease and endemic in 97 countries, this scenario emphasizes the urgency of discovering new drugs and developing new therapeutic systems. In this context, the general objective of this work was to evaluate the leishmanicidal activity of hexamethoxybelanin (S4) and pellitorin amide in vitro and investigate their potential topical application in vivo. For this purpose, strains of Leishmania spp. obtained from the Leishmania Collection bank at Oswaldo Cruz Institute were used. The promastigote forms were cultured in RPMI-1640 medium and evaluated through a growth curve for 12 days. Cytotoxicity was tested on fibroblastic (L929) and human monocytic (THP-1) cell lines using substances S4 and pellitorin. The THP-1 lineage was used as a Leishmania spp. infection model. Infected cells were treated with pellitorin or S4 at varying concentrations to determine IC50 and phagocytic index. For in silico evaluation of the physicochemical properties related to skin permeation, the SwissAdme software was used. The selectivity index was calculated as the ratio between CC50 and IC50. The maximum absorption wavelengths for S4 and pellitorin were determined. Analytical curves (absorbance x concentration) were constructed for both substances using UV-Vis spectrophotometry. Unknown concentrations were calculated using the analytical curve equations. Prolonged-release polymeric films were produced using Eudragit RS 100, propylene glycol, and acetone as the solvent. The components were dissolved, heated, the active substance (S4 or pellitorin) was added, and the solution was evaporated to form the films. Pig ear skins were prepared for permeation and skin retention studies, providing a valid alternative for in vitro evaluation of topical formulations. The assays were performed in Franz cells, collecting samples over 12 hours for permeation analysis, and subsequently, skin retention was evaluated using UV-Vis spectrophotometry methods. Subsequently, an approved study by CEUA FIOCRUZ RONDÔNIA was conducted using female BALB/c mice infected with L. (L.) amazonensis. The animals were treated with polymeric films containing pellitorin or S4, and compared with control groups. Parasite load, biochemical factors, and lesion evolution were assessed. Finally, statistical analyses were performed to interpret the results, using nonlinear regressions to calculate CC50 and IC50, employing GraphPad Prism and Origin. Lesion swelling was assessed with Two-way repeated measure ANOVA and Tukey`s test for multiple comparisons. Differences were considered significant if p < 0.05. Upon analyzing the xvi results, it was observed that pellitorin amide demonstrated a CC50 of 476.8 ± 7.28 µM for THP1 and 363.7 ± 6.36 µM for L929, while substance S4 showed a CC50 greater than 500 µM for both lineages. All strains had a log phase between the 1st and 3rd day. L. (V.) braziliensis had a log phase until the 7th day. The stationary phase varied between the 5th and 9th day. Substance S4 inhibited 50% of L. (L.) infantum/chagasi amastigotes at 145.7 ± 2.8 µM. However, it showed no activity against L. (V.) braziliensis at the highest tested concentration (200 µM), making it impossible to calculate the SI for this species. Nevertheless, the SI of S4 for L. (L.) infantum/chagasi was calculated at 3.43. Pellitorin inhibited 50% of amastigotes in L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum, and L. (V.) braziliensis at 27.31 ± 3.68, 55.12 ± 3.97, and 128 ± 8.48 μM, respectively. Pellitorin showed significant selectivity for L. (L.) amazonensis amastigotes, with a selectivity index (SI) of about 17.45 compared to THP-1 cells and 13.29 compared to L929 cells. For L. (V.) braziliensis, although lower, it still exhibited moderate selectivity, with an SI of approximately 3.72 for THP-1 and 2.83 for L929. For L. (L.) infantum/chagasi, pellitorin demonstrated a selectivity ranging from moderate to high, with an SI of about 8.65 for THP-1 and 6.5 for L929. The data from the analytical curve demonstrated a linear relationship between absorbance and concentration, with high correlation coefficients (0.995 for S4 and 0.999 for pellitorin), meeting ANVISA requirements. In the analysis of skin permeation, the film was applied to pig skin and contained a total estimated amount of 0.111 mg of S4 or pellitorin. After 12 hours, approximately 76.6% of S4 and 6.56% of pellitorin permeated through the skin. As for skin retention, after the same period, approximately 0.01757 mg of S4 and 0.026 mg of pellitorin were retained in the skin. The permeability parameters of substances S4 and pellitorin were determined through the cutaneous permeation test. The constant flux (J) for S4 was 2.69 µg/cm² × h, similar to pellitorin, which was 2.43 µg/cm² × h. The time required to reach the permeation equilibrium was approximately 0.95 hours for S4 and 1.1 hours for pellitorin. The permeability coefficient of S4 was 0.8 times higher compared to pellitorin. Regarding in vivo assays, no significant differences were observed in lesion size and animal weight between the treated groups. However, the analysis of parasite load revealed a reduction in parasitemia in mice treated with the film formulation containing pellitorin (inhibition of 60.71%) or S4 (inhibition of 59.52%), with no significant statistical difference between them. The film formulation alone also showed a reduction in parasitemia (inhibition of 71.54%). All treatments were effective compared to the untreated control group. Serological biochemical assays did not indicate significant differences in urea, creatinine, AST, and ALT levels compared to the untreated control group. This suggests that the analyzed parameters remained within normal limits, indicating that the treatments did not adversely affect these biochemical parameters. In light of the results obtained, it was observed that substance S4 is xvii promising, with low in vitro toxicity (CC50 > 500 µM), and was able to inhibit L. (L.) infantum/chagasi amastigotes in vitro. Pellitorin amide showed remarkable selectivity for L. (L.) amazonensis (SI ~17.45). The cutaneous permeation tests demonstrated that the developed film was able to release both substances (S4 and pellitorin), and these showed high percentages of cutaneous permeation. The in vivo treatments significantly reduced parasitemia without affecting the biochemical parameters, highlighting their efficacy and safety | ||||||||||||||||||||||||
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